استفاده از P32 برای تعیین سویه موثر میکوریزای هم زیست با جو و یونجه

چکیده

تکنیک هاي هسته اي براي تعیین مجاورت، اندازه گیري میزان انتقال و تبادل عناصر بین گیاه و قارچ هاي میکوریزا و انتخاب سویه مؤثر میکوریزا در گیاهان استفاده می شود. به این منظور، دو آزمایش گلدانی جداگانه در قالب طرح کاملاً تصادفی براي تعیین بهترین سویه میکوریزاي هم زیست با یونجه و جو از میان 4 سویه شامل Glomus mosseae، G. etanicatum، G. intraradices و ترکیبی از سویه هاي مختلف (G.mosseae، G.fasciculatum و Gigaspora hartiga) با استفاده از تکنیک رادیوایزوتوپی در پژوهشکده کشاورزي، پزشکی و صنعتی سازمان انرژي اتمی ایران واقع در کرج انجام شد. اعمال P³² در مرحله حداکثر رشد رویشی صورت گرفت. با استفاده از دستگاه شمارش گر بتا میزان واپاشی ارزیابی شد. در جو سویه G. mosseae قابلیت و توانایی جذب P³² بیش تري نسبت به سویه هاي دیگر داشت. گیاهان هم زیست با این سویه داراي اکتیویته برگ، ساقه و سنبله بیشتري بودند. همچنین این گیاهان کارایی بیشتري در تجمع ماده خشک اندام هوایی داشتند. یونجه هم زیست با سویه G. mosseae بیش ترین میزان وزن خشک اندام هوایی، اکتیویته P³² در برگ و ساقه و اکتیویته ویژه را داشت. در کل سویه ها در ایجاد هم زیستی با یونجه و جو تفاوت داشتند. ولی کارایی سویه G. mosseae در جذب P³² سبب افزایش رشد و تولید ماده خشک بیش تر به وسیله جو و یونجه شد که می توان آن را به عنوان سویه برتر معرفی نمود.

 

مقدمه

قارچ هاي میکوریزا یکی از اجزا مهم ریزوسفر محسوب می شوند. این قارچ ها با ریشه هاي 80-90 درصد گیاهان اکوسیستم هاي طبیعی، کشاورزي و جنگل تشکیل هم زیستی می دهند. هم زیستی میکوریزایی در اکوسیستم هاي خشکی روي تغذیه معدنی و آلی گیاه، روابط آب و چرخه کربن، در گیاهان مؤثر می باشد.

قارچ هاي میکوریزا به دلیل افزایش سطح جذب ریشه از طریق ایجاد هیف، سبب افزایش جذب آب و عناصر غذایی به وسیله ریشه گیاهان می شوند. تخمین زده می شود که حدود 80 درصد جذب فسفر گیاه به وسیله قارچ هاي میکوریزا صورت می گیرد. علاوه بر جذب فسفر، این قارچ سبب بهبود جذب نیتروژن، پتاسیم، منیزیم، مس و روي در خاك هاي فقیر نیز می شود

میکوریزا، میزبان خود را به وسیله سیگنال هاي آزاد شده از ریشه گیاه شناسایی و با آن تشکیل هم زیستی می دهد. در غیاب ریشه میزبان این قارچ نمی تواند میسلیوم تولید و چرخه زندگی خود را کامل کند.

ترشحات ریشه گیاه میکوریزایی موجب تحریک جوانه زنی اسپورها و رشد سریع هیف قارچ می شود. اما، ترشحات ریشه گیاهان غیرمیکوریزایی مانند خردل، اسفناج، تاج خروس، چغندرقند و لوپین با جلوگیري از رشد هیف خارج ریشه اي قارچ، مانع از ایجاد هم زیستی می شوند

در گیاهان لگوم هم زیستی با قارچ هاي میکوریزایی، به دلیل نیاز این گیاهان به فسفر زیاد براي تولید گره و تثبیت نیتروژن داراي اهمیت می باشد. تلقیح گیاه یونجه با Glomus mosseae علاوه بر افزایش رشد و جذب عناصر غذایی سبب افزایش فعالیت باکتري Sinorhizobiom meliloti شد. در بررسی که به وسیله گویکوچا و همکاران انجام شد گیاهان یونجه هم زیست با G. fasciculatum داراي قابلیت جذب فسفر بیش تري در مقایسه با سویه هاي دیگر و گیاهان شاهد بودند.

آزمایش هاي گلدانی و اندازه گیري میزان جذب فسفر به وسیله سویه هاي مورد آزمایش روش مرسوم براي تعیین سویه مؤثر میکوریزاي هم زیست با گیاه میزبان می باشد. اما با توجه توسعه تکنیک هاي هسته اي می توان با استفاده از P³² قابلیت جذب و انتقال فسفر به گیاه را در سویه هاي مختلف میکوریزا مورد ارزیابی قرار داد. به دلیل تحرك نداشتن فسفر در خاك، از P³² می توان براي بررسی وضعیت جذب و توزیع فسفر و عناصر غذایی دیگر استفاده نمود.

اطلاعات اندکی در مورد استفاده از P³² براي تعیین سویه مؤثر هم زیست میکوریزا وجود دارد. در آزمایش اردکانی و همکاران که روي گندم انجام شد، گیاهان تلقیح شده با Glomus sp. داراي اکتیویته، اکتیویته ویژه و وزن خشک اندام هوایی بیش تري نسبت به گیاهان غیرمیکوریزایی بودند.

نتایج ژو و همکاران نشان داد، استفاده از P رادیواکتیو می تواند جایگزین مناسبی براي بررسی مستقیم هم زیستی میکوریزایی گونه هاي گیاهی یا ارقام براي انتخاب سویه مؤثر، نسبت به آزمایش هاي رایج گلدانی باشد. در این بررسی گیاهان میکوریزایی جو داراي وزن خشک، اکتیویته و اکتیویته ویژه بیش تري نسبت به گیاهان غیرمیکوریزایی بودند.

با استفاده از P³² می توان قابلیت سویه هاي مختلف در جذب P³² را تعیین نمود که می تواند ملاك مناسبی براي تعیین سویه مؤثر در ایجاد هم زیستی با گیاه میزبان باشد. این آزمایش براي مشخص نمودن اختلاف سویه هاي میکوریزایی در جذب و تخصیص فسفر با استفاده از P³² انجام شد.

 

مواد و روش ها

براي تعیین سویه مؤثر هم زیست و کارایی آن ها در توزیع و تجمع P³² و ماده خشک جو و یونجه دو آزمایش گلدانی جداگانه با 4 سویه میکوریزا به همراه تیمار شاهد با 4 تکرار در قالب طرح کاملاً تصادفی، در شرایط گلخانه و در خاك غیراستریل در پژوهشکده کشاورزي، پزشکی و صنعتی سازمان انرژي اتمی ایران واقع در کرج انجام شد. سویه هاي مورد استفاده عبارت بودند از Glomus mosseae، G. etanicatum، G. intraradices که در مؤسسه تحقیقات خاك و آب تولید شدند و سویه ترکیبی، که ترکیبی از سویه هاي G. mosseae، Gigaspora hartiga و G. fasciculatum بود که به وسیله مؤسسه تحقیقات خاك و آب از هند وارد شد. قبل از انجام آزمایش اصلی سویه ها به روش گلدانی و براساس پیشنهاد نوریس و همکاران تولید شدند. براي این منظور، ابتدا گلدان ها با استفاده از الکل 70 درصد ضدعفونی و در داخل آن ها خاك استریل (مخلوط ماسه و رس به نسبت 4 به 1) ریخته شد. ابتدا بذرهاي سورگوم به مدت 30 ثانیه در اتانول 95 درصد و سپس در محلول کلراید جیوه 15 درصد به مدت 5 دقیقه استریل شدند. پس از اتمام فرآیند استریل، بذرها چند بار با آب مقطر استریل شستشو و آماده کشت شدند. بذرها در محیط آگار کشت و مدت 48 ساعت در داخل انکوباتور قرار داده شدند. براي کاشت در گلدان مقدار 25 گرم مایه تلقیح سویه هاي موردنظر را در قسمت سطحی خاك گلدان ریخته و بذرهاي سورگوم در آن کشت شدند. آبیاري، گلدان ها با آب مقطر هر هفته 2 بار انجام شد. همچنین هر هفته یک بار از محلول غذایی براي تغذیه گلدان ها استفاده شد. سورگوم ها پس از رشد در مرحله ابتداي گل دهی کف بر و پس از 3 هفته به طور کامل ریشه و ماسه خشک شدند. سپس گلدان ها خالی و ریشه ها آسیاب و با ماسه مخلوط شد، تا مایه تلقیح براي استفاده در آزمایش اصلی به دست آید. مایه تلقیح تولیدي شامل اسپور و میسلیوم قارچ بود که براساس پیشنهاد نوریس و همکاران در آزمایش هاي اصلی مورد استفاده قرار گرفت.

براي انجام آزمایش اصلی کاشت در گلدان هاي 10 کیلوگرمی و با تلقیح 50 گرم از مایه تلقیح سویه ها (مصرف به میزان 250-200 اسپور به ازاي هر بذر) صورت گرفت. بذور یونجه نیز قبل از کاشت با باکتري ریزوبیوم Sinorhizobiom meliloti تلقیح شد. پس از تنک 5 بوته در هر گلدان حفظ شد. در مرحله حداکثر رشد رویشی (90 روز پس از کاشت) 3 میلی کوري P³² به صورت اسید ارتوفسفریک با آب مقطر رقیق و به میزان 1 میلی لیتر با استفاده از سرنگ در سطح خاك هر گلدان اضافه شد. میزان اکتیویته موجود براي هر گلدان در زمان مصرف 58/72 نانو کوري بود. اکتیویته ویژه کود نشان دار در این آزمایش 217/09 بکرل بر گرم (Bq/g) بود. در مرحله 20 درصد گل دهی (125 روز پس از کاشت براي جو و 145 روز پس از کاشت براي یونجه) گیاهان کف بر و اندام هوایی پس از تفکیک براي خشک شدن به مدت 48 ساعت در درجه حرارت 70 درجه سانتی گراد در آون قرار داده شدند. سپس نمونه ها توزین شدند. وزن خشک برگ، ساقه و سنبله در جو و وزن خشک برگ و ساقه یونجه تعیین شد. براي تعیین میزان اکتیویته و اکتیویته ویژه گیاه، نمونه هاي خشک آسیاب و با دستگاه شمارش گر بتا مدل Multi: Low Level Counter FHT770 (Eber Line) میزان واپاشی اندازه گیري شد. میزان واپاشی ها براي هر یک از نمونه ها (براساس شمارش در ثانیه) محاسبه و سپس طبق رابطه زیر میزان اکتیویته موجود در هر نمونه ( 1 گرم ماده خشک برگ و ساقه) براساس بکرل (Bq) بیان شد.

 

راندمان/ تعداد واپاشی هاي شمارش شده در ثانیه (CPS) = میزان اکتیویته برگ، ساقه و سنبله

 

از آن جایی که کالیبراسیون سیستم شمارنده با توجه به راندمان چشمه هاي استاندارد براي P³² در روش سیستم گازي تناسبی صورت گرفت، بنابراین در رابطه بالا مخرج کسر برابر با 0/36 می باشد. اکتیویته ویژه، مقدار رادیواکتیو در واحد وزن (یا حجم) کل عنصر موجود می باشد که شامل هر دو فرم ایزوتوپ هاي فعال و پایدار می باشد و با نسبت میزان P³² (میزان اکتیویته) تقسیم بر فسفر کل اندام هوایی گیاه به دست آمد. فسفر کل به روش Spectrophotometric اندازه گیري شد. اکتیویته ویژه در این آزمایش بر حسب (Bq/g) بیان شد. اطلاعات به دست آمده با استفاده از بسته نرم افزاري SAS آنالیز شد. مقایسه میانگین ها با استفاده از آزمون چنددامنه اي دانکن انجام شد.

 

نتایج و بحث

وزن خشک جو و یونجه: نتایج آنالیز واریانس نشان داد که تأثیر سویه هاي مختلف میکوریزا بر وزن خشک ساقه معنی دار بود (جدول 1). سویه G. mosseae بیشترین مقدار این صفت را نسبت به سایر سویه ها تولید کرد (جدول 2). تجمع ماده خشک برگ در تیمارهاي مختلف معنی دار نبود (جدول 1). اما، سویه ترکیبی ماده خشک برگ بیش تري داشت (جدول 2). وزن خشک سنبله جو نیز تحت تأثیر سویه هاي مختلف میکوریزا تغییر معنی داري نداشت (جدول 1). در حالی که، وزن خشک سنبله در تیمار G. mosseae بیش تر بود (جدول 2).

تأثیر سویه هاي مختلف قارچ میکوریزا روي وزن خشک برگ، ساقه و اندام هوایی یونجه معنی دار بود (جدول 3). نتایج مقایسه هاي میانگین ها نشان داد، سویه Glomus mosseae بیشترین میزان وزن خشک ساقه، برگ و اندام هوایی را در یونجه تولید کرد (جدول 4). تفاوت وزن خشک یونجه در میان سویه هاي متفاوت نشان دهنده کارایی سویه هاي مورد استفاده در جذب آب و مواد غذایی و تولید مواد فتوسنتزي می باشد. بررسی این صفات نشان می دهد که این سویه توانایی بیش تري در افزایش وزن خشک هوایی دارد.

نتایج مربوط به تأثیر سویه هاي مختلف روي تجمع ماده خشک نشان داد که G. mosseae داراي بیشترین کارآیی در افزایش ماده خشک برگ، ساقه و سنبله در جو و ماده خشک برگ، ساقه و اندام هوایی در یونجه بود. این نتایج نشان داد که بین سویه هاي مختلف از نظر اختصاص ماده خشک به اندام هاي مختلف تفاوت وجود داشت و داراي کارایی مختلفی در تولید ماده خشک بودند. نتایج دیوپ و همکاران که پاسخ واریته هاي Solanum aethiopicum به سویه هاي مختلف میکوریزا را بررسی کردند، نشان داد که سویه هاي مختلف G. aggregatum، G. mosseae و G. versiforme مورد بررسی، باعث افزایش وزن خشک اندام هوایی و محتواي عناصر معدنی واریته هاي S. aethiopicum شدند و سویه هاي متفاوت کارایی مختلفی در تولید وزن خشک اندام هوایی و میزان عناصر معدنی واریته هاي S. aethiopicum داشتند. محمد و همکاران گزارش دادند که هم زیستی گندم بهاره با میکوریزا سبب افزایش وزن خشک اندام هاي هوایی، تعداد پنجه و طول ریشه شد. همچنین در بررسی دیگر تالکدار و ژرمیدا اثر 3 سویه قارچ میکوریز (G. clarum، G. mosseae و G. versiforme) جداسازي شده از خاك هاي ساسکاچوان را روي رشد و عملکرد گندم بررسی کردند و به این نتایج دست یافتند که G. clarum اثري روي وزن خشک گیاه نداشت، ولی سبب افزایش معنی داري در عملکرد دانه و غلظت فسفر دانه و کل گیاه شد. در این بررسی تنها سویه G. mosseae سبب افزایش ارتفاع گندم شد.

اکتیویته و اکتیویته ویژه جو: نتایج به دست آمده از آنالیزهاي ایزوتوپی نشان داد که اکتیویته P³² در برگ، ساقه و سنبله و اکتیویته ویژه جو تحت تأثیر سویه هاي میکوریزایی قرار گرفت (جدول 1). نتایج آزمون دانکن این صفات نشان داد که از میان سویه هاي میکوریزاي مورد استفاده در این آزمایش سویه G. mosseae در هم زیستی با جو کارایی بیش تري در اکتیویته برگ، ساقه و سنبله و اکتیویته ویژه جو داشت (جدول 2). سویه G. mosseae داراي کارایی بیش تري نسبت به دیگر سویه هاي مورد استفاده در انباشت P³² به وسیله گیاه و همچنین انتقال آن به دانه بود.

در این آزمایش تأثیر سویه هاي مختلف میکوریزا روي میزان اکتیویته برگ، ساقه، اندام هوایی و اکتیویته ویژه یونجه معنی دار بود (جدول 3). اکتیویته برگ، ساقه، اندام هوایی و اکتیویته ویژه یونجه در گیاهان هم زیست با سویه G. mosseae بیش از سایر گیاهان بود (جدول 4). این موضوع بیانگر کارآیی بیشتر این سویه در کمک به جذب فسفر به وسیله گیاه می باشد که می تواند نشان دهنده کارآیی بیش تر هم زیستی یونجه با G. mosseae نسبت به سویه هاي دیگر است.

در هر دو گیاه یونجه و جو G. mosseae یشترین میزان اکتیویته برگ، ساقه، سنبله و اکتیویته ویژه را در جو و اکتیویته برگ، ساقه و اکتیویته ویژه را در یونجه تولید نمود. مهم ترین و معتبرترین اثر میکوریزا روي گیاه میزبان ، افزایش جذب مواد غذایی به ویژه فسفر می باشد. بیش تر نتایج به دست آمده از نقش میکوریزا در افزایش جذب فسفر حکایت دارند. بررسی هاي اسمیت و رید ، برتا و همکاران، اوبا و همکاران و گیوونتی و همکاران نیز نشان داد که مهم ترین نقش هم زیستی میکوریزایی کمک به افزایش جذب فسفر در گیاهان می باشد. علاوه بر این، نتایج دیوپ و همکاران نشان داد که بین سویه هاي مختلف در ایجاد هم زیستی با Solanum aethiopicum تفاوت وجود داشت. این سویه ها از نظر جذب فسفر با یکدیگر اختلاف داشتند. نتایج تالکدار و ژرمیدا نیز نشان داد که بین سویه هاي مختلف میکوریزا در ایجاد هم زیستی با ذرت تفاوت وجود داشت و G. mosseae بیشترین میزان جذب فسفر، سطح برگ و وزن خشک را داشت. رشد و تغذیه معدنی گیاهان به وسیله تلقیح با قارچ هاي میکوریزا افزایش می یابد و بین سویه ها در جذب فسفر تفاوت وجود دارد. بین سویه هاي مختلف در ایجاد هم زیستی با گیاه میزبان و جذب فسفر و عناصر معدنی تفاوت هاي ژنتیکی وجود دارد.

مهم ترین روش در تعیین سویه مؤثر میکوریزا اندازه گیري میزان جذب فسفر به وسیله رابطه گیاه- قارچ می باشد. به همراه آن اندازه گیري وزن خشک و شاخص کلونی زایی میکوریزایی هم می تواند به فرآیند کمک کند. اما همواره افزایش درصد کلونی زایی میکوریزایی موجب افزایش جذب فسفر به وسیله گیاه میزبان نمی شود. از کشت گلدانی و اندازه گیري میزان جذب فسفر و شاخص کلونی زایی به همراه میزان ماده خشک براي تعیین سویه برتر انجام می شود. اما به دلیل تحرك نداشتن فسفر در خاك، از P³² می توان براي بررسی وضعیت جذب و توزیع فسفر استفاده نمود. اطلاعات اندکی در مورد استفاده از P³² براي تعیین سویه مؤثر هم زیست میکوریزا وجود دارد و تنها نتایج اردکانی و همکاران و ژو و همکاران نشان داد، گیاهان میکوریزایی داراي وزن خشک و اکتیویته و اکتیویته ویژه بیش تري نسبت به گیاهان غیرمیکوریزایی بودند.

وجود فسفر نشان دار در ماده خشک گیاه نشان دهنده کارایی قارچ میکوریزا در جذب فسفر می باشد. میزان اکتیویته برگ، ساقه و اندام هوایی و اکتیویته گیاه، مقدار P³² را که به وسیله هم زیستی دوگانه گیاه و میکوریزا جذب می شود را نشان می دهد. بنابراین استفاده از سویه هایی که داراي کارآیی بیش تري در ایجاد هم زیستی با گونه هاي گیاهی هستند، به جذب عناصر غذایی و آب به وسیله گیاهان میزبان کمک می کند. ریشه هاي گیاهان میکوریزایی باعث می شود حجم بیش تري از خاك در اختیار گیاه قرار گیرد. این برتري به دلیل تولید میسلیوم هاي خارجی ریشه می باشد. این موضوع سبب افزایش جذب آب و عناصر غذایی به وسیله گیاهان می شود. در این آزمایش سویه G. mosseae قابلیت و توانایی جذب P³² بیشتري را نسبت به سویه هاي مورد بررسی دیگر نشان داد. کارایی این سویه در جذب P³² سبب افزایش رشد و تولید بیوماس به وسیله جو و یونجه با این سویه شد. بنابراین G. mosseae را می توان به عنوان سویه مؤثر براي جو و یونجه معرفی نمود. با توسعه روش هاي هسته اي می توان از P³² در جهت تعیین و انتخاب سویه هاي برتر استفاده نمود.

جدول 1- تجزیه واریانس تأثیر سویه هاي مختلف قارچ میکوریزا روي صفات مورد بررسی جو.

منابع تغییرات	درجه آزادي	وزن خشک ساقه	وزن خشک برگ	وزن خشک سنبله	اکتیویته برگ	اکتیویته ساقه	اکتیویته سنبله	اکتیویته ویژه
تیمار	4	11/60**	3/17ns	2/58ns	53834/71**	469357/34**	1211953/26**	6283/08**
خطا	15	1/38	0/90	0/98	1122/84	2893/34	12978/41	21/09
CV (درصد)		6/56	8/52	12/99	9/90	8/80	14/63	4/77
** معنی دار در سطح احتمال 1 درصد و ns غیر معنی دار

جدول 2- مقایسه میانگین هاي تأثیر سویه هاي مختلف قارچ میکوریزا روي صفات مورد بررسی جو.

سویه هاي میکوریزا	وزن خشک برگ (گرم در گلدان)	وزن خشک ساقه (گرم در گلدان)	وزن خشک سنبله (گرم در گلدان)	اکتیویته برگ (بکرل)	اکتیویته ساقه (بکرل)	اکتیویته سنبله (بکرل)	اکتیویته ویژه جو (بکرل بر گرم)
G. mosseae	11/82ab	20/82a	8/82a	515/3a	57/87a	1782/03a	166/92a
G. intraradices	10/55bc	16/40b	7/47ab	380/95b	21/9c	332/93d	72/73c
G. etanicatum	9/95c	17/37b	7/8b	220/98d	32/45b	632/26bc	81/77b
سویه ترکیبی	12/10a	17/62b	7/42ab	322/33c	29/47b	484/54cd	77/88c
شاهد	11/25abc	17/27b	6/60c	254/14d	23/7c	715/07b	82/5b
حروف مشابه در هر ستون نشان دهنده نبود اختلاف معنی دار می باشد.

جدول 3- تجزیه واریانس تأثیر سویه هاي مختلف قارچ میکوریزا روي صفات مورد بررسی یونجه.

منابع تغییرات	درجه آزادي	وزن خشک ساقه	وزن خشک برگ	وزن خشک اندام هوایی	اکتیویته برگ	اکتیویته ساقه	اکتیویته اندام هوایی	اکتیویته ویژه گیاه
تیمار	4	7/05**	5/37**	19/39**	839649/57**	1064986/7**	3854752/84**	2746/69**
خطا	15	2/05	0/57	2/69	3296/05	8054/78	11623/91	4/98
CV (درصد)		8/42	6/52	5/75	7/03	11/54	6/51	4
** معنی دار در سطح احتمال 1 درصد.

جدول 4- مقایسه میانگین هاي تأثیر سویه هاي مختلف قارچ میکوریزا روي صفات مورد بررسی یونجه.

سویه هاي میکوریزا	وزن خشک برگ (گرم در گلدان)	وزن خشک ساقه (گرم در گلدان)	وزن خشک اندام هوایی (گرم در گلدان)	اکتیویته برگ (بکرل)	اکتیویته ساقه (بکرل)	اکتیویته اندام هوایی (بکرل)	اکتیویته ویژه یونجه (بکرل بر گرم)
G. mosseae	13/55a	19/1a	32/15a	1607/47a	1694/69a	3389/93a	101/47a
G. intraradices	11/25ab	17/25ab	28/85ab	673/3bc	583/31bc	1324/79b	45/93c
G. etanicatum	10/47b	16/52b	27b	428/55b	556/91bc	1006/42c	37/36e
سویه ترکیبی	11/17b	15/52b	27/7b	755/46b	600/89b	1416/1b	53
شاهد	11/25b	16/57b	27/82b	612/25c	451/63c	1144/33c	41/1d
حروف مشابه در هر ستون نشان دهنده نبود اختلاف معنی دار می باشد.