Please Wait

فرهاد رجالي 6 ماه پیش 0 نظر

چکیده

مهمترین محدودیت براي بکارگیري وسیع همزیستی میکوریزي در اراضی زراعی و باغی، طبیعت همزیست اجباري بودن این قارچها میباشد که تولید صنعتی مایه تلقیح این قارچها را تاکنون با مشکل مواجه نموده است. براي فائق آمدن بر این مشکل روشهاي مختلفی از جمله هیدروپونیک، آئروپونیک و کشت همزمان ریشه و قارچ ارائه گردیده است. هریک از این روشها،توانائیها و محدودیتهایی براي تکثیر این نوع قارچها را دارا میباشد. هدف از انجام این تحقیق بررسی کارایی روش کشت درون شیشهاي ریشههاي القایی براي تکثیر گونه هاي مختلف قارچهاي میکوریز آربسکولار است. بدین منظور در ابتدا با استفاده از سه سویه Agrobacterium rhizogenes و دیسک هاي استریل هویج، تلاش شد تا ریشههاي القایی مورد نیاز براي تکثیر قارچهاي میکوریزي تهیه گردد. نتایج اولیه نشان داد که ریشههاي القایی در بافت گیاهی هویج تشکیل گردید. این ریشه ها براي انجام مرحله بعدي مورد استفاده قرار گرفتند. اسپورهاي سه گونه از قارچهاي میکوریزي به نامهاي Glomus intraradices، Glomus etunicatum و Glomus mosseae در مجاورت ریشه گیاه سورگم در طی یک دوره چهار ماهه تکثیر شده و پس از جداسازي از خاك با استفاده از آنتی بیوتیکهاي استرپتومایسین سولفات و جنتامایسین سولفات ضدعفونی سطحی و در شرایط کاملاً استریل در مجاورت راس ریشههاي القایی حاصل از دیسک هویج بر روي محیط کشت Medium قرار داده شدند. پس از برقراري رابطه همزیستی بین دو ارگانیسم، براي تکثیر همزمان، ریشههاي همزیست شده با قارچ به ظروف شیشهاي 250 میلی لیتري حاوي 100 میلی لیتر محیط کشت Medium منتقل گردیدند. پس از گذشت 8 هفته محتویات ظروف شیشهاي از محیط کشت جداسازي و تعداد اسپورهاي تشکیل شده در آنها شمارش گردید. نتایج این تحقیق نشان داد که اولاً ریشههاي القایی تشکیل شده به خوبی در محیط کشت سنتز شده رشد کرده و پایداري ژنتیکی خود را حفظ نمودند و همچنین مشخص گردید که روش کشت درون شیشهاي بر اساس مواد و روشهاي بکار گرفته شده در این پژوهش مناسب براي تکثیر دو قارچ G. intraradices و G.etunicatum میباشد، لیکن قارچ G.mosseae در این روش تکثیر اسپورزایی نکرد و براي تکثیر آن توصیه میشود یا تغییراتی در روش بکار گرفته شده اعمال گردد و یا از روشهاي دیگري مثل هیدروپونیک و آئروپونیک استفاده گردد.

 

مقدمه

اساس روش کشت همزمان ریشه و قارچ به صورت درون شیشه اي (in-vitro) بر تهیه ریشه هاي القایی حاصل از تأثیر Agrobacterium rhizogenes بر بافت هاي مناسب گیاهی، تلقیح این ریشه ها با اسپورهاي ضد عفونی شده سطحی قارچهاي میکوریز آربسکولار و در نهایت ایجاد شرایط لازم براي رشد و تکثیر این ریشه ها استوار می باشد.

تاناکا و همکاران با تلقیح دیسک ریشه هاي غده اي شلغم و تربچه با A. rhizogenes سویه A4 بعد از 10 روز اولین علائم ظهور ریشه هاي القایی را گزارش دادند، ریشه هاي بوجود آمده داراي انشعابات زیاد، رشد سریع در محیط کشت فاقد هورمونهاي رشد و داراي زمینگرایی منفی بودند. نودا و همکاران دیسک هاي برگی (به قطر 6 میلی متر) نوعی تربچه را با فرو بردن به مدت 10 دقیقه در سوسپانسیون A. rhizogenes سویه A4 تلقیح کرده و پس از گذشت 10 روز از زمان تلقیح ریشه هاي القایی در تاریکی بوجود آمدند. ریشه ها بدون حضور هورمونهاي رشد، سریعاً منشعب و در محیط پراکنده شدند. تریپستین تأثیر سویههاي مختلف آگروباکتریوم بر گیاهچه Echinacea purpura به منظور تهیه ریشه القایی را بررسی کرده و نشان داد که سویه هاي LMG63 و LMG150 تنها باعث ایجاد بافت کالوس میشوند. لیکن سویه هاي 15834 و R1601 در محل تلقیح منجربه تشکیل ریشه هاي القایی شدند.

تلاشهاي صورت گرفته براي کشت هم زمان ریشه و قارچ تا سال 1985 همگی محدود به استفاده از کشت بافت ریشه هاي معمولی بوده است. اولین گزارش مبنی بر استفاده از ریشه هاي القایی حاصل از تلقیح A. rhizogenes و به منظور کشت ریشه و قارچ در سال 1987 انتشار یافت. موگنیر و موسه با موفقیت توانستند ریشه هاي القایی گیاه پیچک (Convolvulus sepium) را با اسپور قارچ Glomus mosseae و در محیط سنتز شده کلونیزه نمایند، لیکن کشت هم زمان ریشه و قارچ منجربه تشکیل اسپورهاي جدید این قارچ نگردید.

اولین گزارش مبنی بر اسپورزایی قارچهاي میکوریز آربسکولار در محیط کشت سنتز شده مربوط به سال 1988 می باشد. بکارد و فورتین با تغییر ترکیب شیمیایی محیط کشت ریشه و معرفی محیط کشت جدیدي به نام محیط حداقل یا محیط M1 و استفاده از آن به جاي محیط کشت White محدودیت ناشی از غلظت بالاي عناصر معدنی براي اسپورزایی این قارچها بود، برطرف گردید و بدین صورت هم رشد ریشه متوقف نگردید و هم قارچ Gigaspora margarita در محیط سنتز شده اسپورزایی نمود.

در همان سال هوآنگ و سیلویا با استفاده از گیاههاي Paspalumnotatum و Ipomoea batatas که با گونه هاي G. deserticola، G. etunicatum و G. intraradices تلقیح و به محیط کشت آئروپونیک منتقل شده بودند، اسپورزایی این گونه ها در محیط استریل مشاهده گردید.

استرولا و رومند پیشنهاد کردند به منظور نگهداري و تکثیر ریشه هاي القایی کلونیزه شده با قارچ هاي میکوریز آربسکولار از کشت متوالی آنها در محیط هاي کشت جدید استفاده گردد و متعاقب این عمل ریشه به رشد خود ادامه داده و به همراه آن، اندام فعال قارچی نیز در محیط کشت جدید تکثیر می گردد. با تلقیح ریشه هاي القایی حاصل از دیسک هویج با تنها سه اسپور استریل سطحی شده Gi.margarita و برقراري شرایط مناسب در طول یک سال در پلیت هاي 9 سانتی متري بیش از 500 اسپور از این قارچ بوجود آمد. بکارد و پیچ با ممانعت از خشک شدن محیط کشت، توانستند اسپورهاي تشکیل شده را تا یک سال بعد در همان پلیت ها نگهداري نموده و ضمن پایداري قدرت رویشی، تعداد آنها را به هزاران اسپور افزایش دهند. دکلرك و همکاران توانستند با استفاده از قطعات ریشه اي استریل و کلونیزه شده با G. versiforme به طول 5 میلی متر و قرار دادن آنها در مجاورت ریشه هاي القایی در محیط کشت MS2 در طی یک دوره زمانی 5 ماهه، بیش از 9500 اسپور این قارچ را در هر پلیت 9 سانتی متري تولید نمایند.

ادهولیه و همکاران گزارش کردند که در همزیستی بوجود آمده بین ریشه هاي القایی هویج و قارچ میکوریزي Gi.margarita چنانچه به جاي آگار خالص از فیتاژل استفاده شود تعداد نقاط ورودي هیف قارچ به داخل بافت ریشه و همچنین تعداد سلولهاي کمکی تولید شده در محیط کشت درون شیشه اي افزایش می یابد.

ویمارد و همکاران با انجام تحقیقی در ارتباط با مقایسه کارایی مایه تلقیح قارچ G. intraradices که به دو روش کشت درون شیشه اي و کشت گلدانی تهیه و براي کلونیزه کردن ریشه گیاه پیاز به کار رفت نشان داد که بین این دو مایه تلقیح تفاوت معنی داري وجود ندارد، با این توضیح که مایه تلقیح تهیه شده از روش کشت درون شیشهاي فاقد هر گونه آلودگی جانبی بوده ولی مایه تلقیح حاصل از کشت گلدانی حاوي آلودگیهاي قارچی و باکتریایی بوده است.

در تحقیق دیگري محققین موفق شدند از تکه هاي ریشه اي حاوي هیف قارچهاي میکوریز آربسکولار و همچنین تک وزیکولهاي این قارچها و استفاده از ریشه هاي القایی هویج، کشت درون شیشه اي گونه هاي Glomus versiforme، G. intraradices، G. fasciculatum و G.macrocarpum را به انجام برسانند. طبق نتایج دکلرك و همکاران دو گونه اول به شدت در محیط اسپورزایی کردند، گونۀ سوم به میزان کمتر و گونه چهارم تنها چند عدد اسپور در محیط کشت تولید کرد.

تلقیح ریشه هاي القایی هویج با اسپورهاي قارچ Gigaspora margarita منجر به رشد و توسعه اندام این قارچ در محیط کشت شد. طبق گزارش گادکار و ادهولیه 10 الی 15 درصداز اسپورهاي تولید شده این قارچ درون بافت ریشه هاي القایی بوجود آمده اند که بررسی هاي صورت گرفته نشان دهندة شباهت کامل آنها با اسپورهاي تولید شده در خارج از بافت ریشه می باشد. این اولین گزارش از تشکیل اسپور این قارچ درون بافت ریشه است.

دکلرك و همکاران با بررسی اسپورزایی گونه هاي G.intraradices، G. proliferum و G. caledonium به طریقه کشت درون شیشه اي، نشان دادند که تولید اسپور قارچهاي میکوریز آربسکولار در محیط کشت از یک منحنی S شکل تبعیت می کند که داراي سه مرحله است. مرحله تأخیر که در آن اسپوري تولید نمی شود. مرحله دوم که در آن با گذشت زمان اسپورهاي تولید شده افزایش می یابد و در نهایت مرحله سوم که در آن با گذشت زمان تعداد اسپورهاي تولید شده ثابت می باشد.

جاج و همکاران در طی تحقیق صورت گرفته بر روي قارچ G. intraradices نشان دادند که چنان چه اسپورهاي این قارچ قبل از کشت به طریقه دورن شیشه اي، حداقل به مدت 14 روز در دماي +4oC قرار گیرند، جوانه زنی اسپور بیشتر شده، حرکت هیف قارچ به سمت ریشه هاي القایی سریعتر صورت گرفته و در نهایت کلنیزاسیون ریشه به نحو مؤثرتري انجام می پذیرد.

دالپه و دکلرك با انجام تغییراتی در ترکیب محیط کشت استفاده شده توانستند براي اولین بار تلقیح ریشه هاي القایی هویج را با استفاده از اسپورهاي استریل شده گونه Acaulosporarehmi با موفقیت به انجام برسانند. اندام فعال قارچ پس از کلنیزاسیون ریشه در محیط کشت گسترده شده و قارچ توانسته است با تکمیل سیکل زندگی خود، اسپورزایی نماید.

هدف از انجام این تحقیق تلاش براي بومی سازي تکنیک کشت درون شیشهاي براي تکثیر قارچهاي میکوریز آربسکولار میباشد. این کار در مرحله اول بر مبنی تهیه ریشههاي القایی از دیسک ریشهاي هویج استوار بوده که به دلیل پایداري ژنتیکی هم اکنون به عنوان یک وسیله و روش آزمایشگاهی مناسب براي تحقیق پیرامون جنبه هاي مختلف رابطه همزیستی میکوریزي مورد توجه محققین این رشته علمی قرار گرفته و در مرحله دوم بررسی امکان استفاده از این روش براي تکثیر سه گونه قارچ میکوریز آربسکولار بومی و جداسازي شده از خاكهاي کشور است.

 

مواد و روش ها

سویه هاي باکتري

در این پژوهش سه سویه باکتري Agrobacterium rhizogenes شامل سویه هاي A4S، A4V (جداسازي شده از ریشه گیاه رز در کالیفرنیا) ارسالی از دانشگاه مک گیل کانادا و یک سویه منصوب به این باکتري تهیه شده از مرکز تحقیقات ملی ژنتیک و علوم زیستی مورد استفاده قرار گرفت.

 

تهیه بافت هاي گیاهی موردنیاز هویج

بر اساس روش ارائه شده توسط ریدر و همکاران غده هاي ریشه اي هویج تازه خریداري شد از بازار، بعد از شستشو با آب و مایع ظرفشویی به مدت 30-45 ثانیه، درون الکل 96 درجه فرو برده شدند. سپس هویج ها در محلول وایتکس صنعتی 20% به مدت 15-20 دقیقه ضدعفونی سطحی شدند. بعد از این مرحله هویج ها 3-4 مرتبه با آب استریل آبکشی شدند و از این غده هاي ریشه اي استریل براي تلقیح با باکتري استفاده گردید.

 

تلقیح بافت گیاهی با باکتري

تهیه کشت باکتري

باکتري ها از روي محیط نگهداري اسلنت شده، بر روي محیط کشت YMA جامد کشت داده و در دماي 250C در تاریکی انکوبه شدند. بعد از 48 ساعت انکوباسیون، بر اساس روش ارائه شده توسط کر و موگنیر از باکتري هاي رشد کرده بر روي ای محیط براي تلقیح دیسکهاي هویج استفاده شد.

 

تلقیح دیسک هاي هویج با باکتري

بر اساس توصیه ریدر و همکاران دو سانتی متر از انتهاي ریشه هاي غده اي استریل هویج قطع و ریشه هاي پوست کنده شده به صورت دیسک هایی با ضخامت 5-10 میلی متر بریده و سپس سطح رو به نوك ریشه دیسک ها در ناحیه کامبیوم با باکتري مورد نظر از روي محیط جامد تلقیح شدند. تعدادي از دیسک هاي تلقیح شده روي محیط آب- آگار (0/8%) و تعدادي هم بر روي محیط MS قرار داده و تحت نور ضعیف 350 لوکس در دماي 250C انکوبه شدند. تعدادي از دیسک هاي هویج بدون تلقیح به عنوان شاهد تحت همان شرایط نگه داري گردیدند.

 

آلودگی زدایی و پایداري ریشه ها

بعد از ظهور ریشه هاي القایی بر روي بافت هاي تلقیح شده (که از نظر مورفولوژي با ریشه هاي معمولی متفاوت بودند) و بعد از اینکه طول ریشه ها به 4-5 سانتی متر رسید، انتقال ریشه ها و حذف باکتري A.rhizogenes بر اساس روش گولد و همکاران انجام شد.

 

تهیه اسپور قارچهاي میکوریز آربسکولار

اسپورهایسه گونه قارچ میکوریزي با نام Glomus intraradices، Glomus etunicatum و Glomus mosseae طبق روش ارائه شده توسط موکرجی و همکاران در طی یک دوره کشت چهار ماهه در مجاورت ریشه گیاه سورگوم در محیط متشکل از سه قسمت ماسه و یک قسمت خاك با بافت لوم که به همراه گلدان 4 کیلوگرمی حاوي آنها استریل شده بود درگلخانه با نور طبیعی و درجه حرارت 160C الی 280C و طول روز 14 ساعت روشنایی و 10 ساعت خاموشی تکثیر گردیدند.

 

کشت همزمان ریشه القایی و اسپور قارچها

بدین منظور از قرار دادن تکه هاي ریشه هاي القایی به طول 3 الی 4 سانتی متر بر روي محیط کشت M پیشنهادي توسط بکارد و فورتین استفاده گردید. براي کلنیزه کردن این ریشه ها، در هر پلیت تعداد 10 الی 12 اسپور ضدعفونی سطحی شده با روش بکارد و پیچ از سه گونه قارچ میکوریزي (در هر پلیت از یک گونه استفاده گردید و براي هر گونه قارچ 50 پلیت در نظر گرفته شد) را در مجاورت رأس ریشه هاي فرعی قرار داده و پس از مسدود کردن درب پلیت ها با پارافیلم، پلیتها به صورت معکوس درون انکوباتور با دماي 280C و در تاریکی مطلق قرار داده شدند. پس از گذشت دو هفته الی یک ماه از اتمام این مرحله پلیتها به صورت روزانه با استفاده از استریومیکروسکوپ مورد بررسی قرار گرفته و با مشخص نمودن قطعات ریشه اي که با اسپور قارچ کلونیزه و در اطراف ریشه شبکه هیف قارچ گسترده شده بودند، براي تکثیر این گونه از قارچهاي میکوریز آربسکولار با روش پیشنهادي فورتین و همکاران استفاده گردید.

 

تکثیر سه گونه قارچ میکوریزي به طریقه کشت درون شیشه اي

در مرحله تکثیر از بطريهاي شیشه اي درپیچ دار با حجم 250 میلی لیتر حاوي 100 میلی لیتر محیط کشت M استریل به همراه 0/3 درصد فیتاژل استفاده گردید. در شرایط کاملاً استریل درب پلیتها باز شده و ریشه هاي کلنیزه شده با قارچ با بریدن محیط کشت اطراف آن به همراه تکه اي از محیط کشت به درون بطريهاي شیشه اي منتقل گردیدند. درب بطريهاي شیشه اي بسته و پس از مسدود کردن کامل آنها با پارافیلم، درون انکوباتور با دماي W به مدت 12 هفته نگهداري شدند.

 

جداسازي و شمارش اسپورهاي تشکیل شده

براي جدا کردن اسپورهاي تشکیل شده درون محیط کشت از بافر سیترات سدیم 10 میلی مولار استفاده گردید. بر اساس روش دکلرك و همکاران پس از باز شدن کامل ژل بافر سیترات سدیم و اسپورهاي رها شده در ژل، اسپورها به الک 400 مش منتقل و با مقدار کافی آب تا حذف کامل بافر سیترات سدیم شستشو داده شدند. پس از اتمام شستشو، اسپورها به بشر حاوي آب مقطر منتقل گردیدند. براي شمارش تعداد اسپورهاي تولیدي، حجم مشخص از بشر حاوي آب مقطر و اسپورها به کاغذ صافی شبکه بندي شده منتقل گردیده و با استفاده از دستگاه استریومیکروسکوپ، تعداد اسپورها شمارش گردید.

 

تعیین درصد کلنیزاسیون ریشه القایی با قارچهاي میکوریزي

پس از گذشت 12 هفته از تهیه مایه تلقیح دو گونه قارچ میکوریزي به روش کشت درون شیشه اي، مقدار کافی از ریشه هاي تولید شده برداشت و با استفاده از ماده تریپان بلو در لاکتوگلیسیرول رنگ آمیزي گردیدند. براي اندازه گیري درصد کلنیزاسیون ریشه یک صد قطعه یک سانتی متري از ریشه هاي رنگ آمیزي شده را بر روي چهار لام میکروسکوپ قرار داده و با اضافه کردن چند قطره محلول لاکتوگلیسیرول، ریشه ها با لامل پوشانیده شدند. با بررسیهاي میکروسکوپی با بزرگنمایی 250X براي هر قطعه یک سانتی متري ریشه، درصد کلنیزاسیون تعیین و میانگین درصد کلنیزاسیون قطعات ریشه اي محاسبه گردید.

 

نتایج

تولید ریشه هاي القایی

بر روي دیسکهاي هویج تلقیح شده با باکتري 1 تا 6 هفته بعد از انکوباسیون، بافت کالوس تشکیل گردید و 4-5 روز بعد، از محل بافت کالوس بوجود آمده، ریشه هایی موئی ظاهر گردیدند.

این نتایج در مورد دیسکهاي تلقیح شدهاي می باشد که بعد از تلقیح بر روي محیط آب-آگار قرارگرفته بودند ، اما در مورد دیسکهایی که بعد از تلقیح بر روي محیط MS قرار گرفتند، زمان ظهور ریشه کوتاهتر بود، لیکن آلودگی نمونهها در این محیط بسیار بالا و به دلیل این آلودگی زیاد درصد دیسکهایی که موفق به تشکیل ریشههاي القایی گشتند، بسیار ناچیز بود.

در دیسکهاي تلقیح شده با هر سه سویه باکتري، علاوه بر ریشههاي القایی که در سطح رو به نوك ریشه یعنی apical تشکیل شده بود، ریشههاي موئی با تراکم کمتر در سطح رو به بخش هوایی یعنی basal نیز تشکیل شدند.

درصد تشکیل ریشه هاي القایی در دیسکهاي هویج تلقیح شده با سه سویه باکتري که بر روي محیط آب-آگار قرار گرفته بودند ، در جدول 1 آورده شده است. رشد ریشه هاي القایی به طور میانگین 4/1 میلی متر در روز اندارهگیري گردید. در نمونههاي شاهد بعد از یک هفته کالوسهایی غیر از دیسکهاي تلقیح شده، ایجاد شد، اما از آن کالوسها حتی بعد از گذشت 2 ماه نیز ریشه اي ظاهر نشد.

شکل 1 - تصویر سمت چپ یک دیسک تلقیح شده را نشان می دهد که بعد از 5-6 هفته از محل کالوسهاي ایجاد شده، ریشههاي باریک و انبوهی مشاهده گردید. تصویر سمت راست نشان دهنده دیسک هویجی است که بدون تلقیح با باکتري و به عنوان شاهد در نظر گرفته شده است.
جدول 1 - اثر مختلف باکتري A.rhizogenes در تولید ریشه هاي القایی در دیسکهاي هویج
نوع سویه تعداد دیسک تلفیح شده تعداد دیسک ریشه دار شده درصد تشکیل ریشه هاي القایی
A4V 25 9 36
A4S 25 12 48
منصوب به این باکتري 25 11 44
شاهد 25 0 0

 

آلودگی زدایی باکتري از ریشه هاي القایی

ریشه هاي القایی همان طور که گفته شد براي آلودگیزدایی باکتري A.rhizogenes بر روي محیط MS حاوي آنتی بیوتیک سفوتاکسیم قرار داده شدند. تصاویر زیر نشان دهنده ریشه هاي قرار داده شده بر روي این محیط می باشند.

شکل 2 - ریشه هاي القایی بر روي محیط MS حاوي آنتی بیوتیک سفوتاکسیم

 

ضد عفونی سطحی اسپور قارچهاي میکوریزي

نتایج نشان داد که حدود 70 درصد از اسپورها پس از گذشت چندین هفته بر روي محیط کشت MS (بدون ایجاد لکه ناشی از رشد میکروبی در محیط پیرامون خود) هیچ گونه آلودگی سطحی نداشتند. معمولاً در روشهاي استریل سطحی، در مورد اسپورهاي قارچهاي میکوریز آربسکولار آنچه که از اهمیت ویژه اي برخوردار است، حفظ قدرت جوانه زنی و رویش اسپور همراه با حذف آلودگیهاي سطحی می باشد. بنابراین حذف کامل آلودگیها غیر ممکن بوده و در صورت امکان قدرت رویشی اسپور را نیز از بین می برد.

 

برقراري رابطه همزیستی بین ریشه هاي القایی هویج و اسپور سه گونه قارچ میکوریزي

نتایج نشان داد که در 40 پلیت از 50 پلیت که از گونه G. intraradices به عنوان قارچ همزیست استفاده شده بود، رابطه همزیستی برقرار شده و قارچ قسمت عمدهاي از حجم پلیت را با گسترده کردن هیفهاي خود و تولید اسپور اشغال کرده بود.

در 15 پلیت از 50 پلیتی که از قارچ G. etunicatum به عنوان قارچ همزیست استفاده گردید، رابطه همزیستی میکوریزي برقرار و گسترده شدن شبکه میسلیومی قارچ در این پلیتها مشاهده گردید. در 5 پلیت از 50 پلیتی که از قارچ G. mosseae به عنوان قارچ همزیست استفاده شد، گسترده شدن هبف قارچ در پلیت مشاهده گردید، لیکن در هیچ یک از موارد تولید اسپور در پلیت مشاهده نگردید.

شکل 3 - کشت همزمان ریشه هاي القایی و اسپور سه گونه قارچ میکوریزي

 

تکثیر سه گونه قارچ میکوریزي به طریقه کشت درون شیشه اي

نتایج کشت همزمان ریشه و سه گونه قارچ میکوریزي در بطريهاي درپیچ دار 250 میلی لیتري با گذشت زمان 12 هفته، نشان داد که در اکثر بطري هاي حاوي قارچ G. intraradices (بیش از 90 درصد) قارچ دوره رویشی و زایشی خود را تکمیل کرده و محیط 100 میلی لیتري درون بطري مملو از اسپور قارچ و شبکه گسترده هیف این قارچ شد. در بطريهاي حاوي قارچ G. etunicatum تنها در 10 درصد از موارد، قارچ سیکل زندگی خود را طی کرده و اسپورزایی قارچ مشاهده گردید. در بطريهاي حاوي قارچ G.mosseae اگرچه در مواردي گسترده شدن شبکه هیف قارچ مشاهده گردید، لیکن در هیچ مورد تکمیل شدن سیکل زندگی قارچ و تشکیل اسپورهاي قارچ درون محیط کشت مشاهده نگردید.

 

جداسازي اسپورهاي تشکیل شده از محیط کشت و شمارش آنها

میزان اسپور تولید شده در محیط کشت حاوي قارچ G. intraradices حدود 100 تا 110 هزار در 100 میلی لیتر از محیط کشت شمارش گردید. این میزان در مورد قارچ G. etunicatum حدود 30 درصد مقدار ذکر شده یعنی 30 تا 35 هزار به ازاء هر 100 میلی لیتر از محیط کشت شمارش گردید. در مورد قارچ G.mosseae نیز هیچ اسپوري در محیط کشت تشکیل نشد.

 

تعیین درصد کلنیزاسیون ریشه القایی با قارچ هاي میکوریزي

در مورد دو قارچ G. etunicatum و G. intraradices درصد کلنیزاسیون ریشه به ترتیب حدود 70 و 80 درصد اندازهگیري شد.

 

نتیجه گیري

نتایج به دست آمده در این پژوهش در ارتباط با سرعت تشکیل ریشه هاي القایی در دیسک هاي هویج بر روي محیط غنی MS در مقایسه با محیط ضعیف آب-گار، نشان داد که محیط هاي غنی مثل MS به تشکیل ریشه هاي موئی شکل کمک می کند. خروج قطعه T-DNA از پلاسمید Ri سلول باکتري و ورود آن به سلول گیاهی نتیجه فعالیت هاي ژن هاي ویرولانس قرار گرفته بر روي پلاسمید Ri می باشد. شرایط محیطی و از جمله غنی بودن محیط کشت استفاده شده کمک فراوانی به القاء ژن هاي ویرولانس و در نتیجه تشکیل ریشه هاي موئی می کند. تنها مشکلی که در استفاده از محیط MS با آن روبرو بودیم، رشد و تکثیر بیش از حد باکتري A. rhizogenes در این محیط بود که پس از چند روز، پوسیدگی دیسکهاي هویج را در پی داشت. بنابراین می توان توصیه نمود که در مورد دیسکهاي هویج به جاي استفاده از محیط MS غنی، از محیط آب- اگار استفاده گردد. نتایجی که از تلقیح دیسک هاي هویج با سه سویه باکتري به دست آمد نشان داد که هر سه سویه باکتري قادر به القاء ریشه هاي موئی در هر دو قطب دیسک هاي هویج می باشند و بنابراین هر سه این سویه ها در گروه سویه هاي غیرقطبی قرار می گیرند. به عبارت دیگر هر سه سویه در قطعه T-DNA خود داراي ژن هاي سنتزکننده هورمون اکسین هستند و بنابراین بدون احتیاج به اکسین مکمل خارجی باعث تکثیر ریشه در دو طرف دیسک هاي هویج می شوند.

پایداري ریشه هاي القاء شده بوسیله باکتري A.rhizogenes نتیجه ادغام موفق T-DNA درون ژنوم گیاهی و بیان ژن هاي مستقر در آن می باشد. آنچه که از نظر این پژوهش اهمیت داشت، توانایی رشد این ریشه ها در محیط هاي سنتز شده آزمایشگاهی و امکان تکثیر قارچ هاي میکوریز آربسکولار توسط این ریشه ها بود که بخش دوم این پژوهش را تشکیل داد.

تکثیر قارچ G.intraradices به طریقه کشت درون شیشه اي و بررسی خصوصیات کمی و کیفی مایه تلقیح تهیه شده نشانگر پتانسیل بسیار بالاي این روش براي تکثیر این گونه از قارچهاي میکوریز آربسکولار می باشد. اضافه کردن حجم محیط کشت به 100 میلی لیتر و همچنین استفاده از بطري هاي شیشه اي درپیچ دار با حجم 250 میلی لیتر که فضاي کافی براي گسترش ریشه هاي القایی کلنیزه شده با قارچ را دارا می باشند و همچنین استفاده از ماده ژل کننده فیتاژل به جاي آگار که جمع آوري تمامی اسپورها و هیف هاي تشکیل شده درون محیط کشت را امکان پذیر می نماید، باعث تبدیل این روش از یک وسیله صرفاً تحقیقاتی به روشی مؤثر جهت تکثیر این قارچ ها گردیده است. میزان اسپور تولیدي در این روش به ازاء 100 میلی لیتر ازمحیط کشت و پس از گذشت 12 هفته بالغ بر 100,000 عدد می باشد. با احتساب تکه هاي ریشه کلونیزه شده با قارچ که چیزي در حدود 50 الی 70 درصد از کل ریشه ها بوده و همچنین تکه هاي هیف این قارچ که داراي قدرت رویشی و در مجموع تعداد آنها سه برابر تعداد اسپور تولیدي می باشد، به عدد 400,000 اندام فعال قارچی به ازاء هر 100 میلی لیتر از محیط کشت رسیدیم، لیکن در مورد قارچ G. etunicatum مشاهده گردید که این روش از کارایی کمتري برخوردار و میزان اسپور تولیدي نیز حدود 30 درصد گونه قبلی میباشد، ولی باز در مقایسه با روشهاي تولید مایه تلقیح این قارچ به روش سنتی، روش کشت درون شیشه اي از نظر کیفیت، کارایی، خلوص مایه تلقیح تولیدي و عاري بودن آن از آلودگی هاي جنبی قابل توصیه میباشد. میزان اسپور تولیدي توسط این دو قارچ تا حدودي شبیه به نتایج ارائه شده توسط سایر محققین می باشد. اگرچه باید توجه داشت که گونههاي مختلف قارچ هاي میکوریز آربسکولار توانایی متفاوتی در اسپورزایی در روش کشت درون شیشهاي از خود نشان میدهند. تاکنون بیشترین میزان اسپور تولیدي در کشت درون شیشه اي در قارچ G.intraradices شمارش گردیده است.

تکثیر قارچ G.mosseae به روش کشت درون شیشهاي با مواد و روشهاي استفاده شده در این تحقیق میسر نگردید. لذا توصیه میشود براي استفاده ازپتانسیل خوب این قارچ در اراضی زیر کشت گیاهان زراعی، روش کشت درون شیشهاي براي تکثیر این قارچ، اصلاح شده و یا اینکه از روشهاي پیشرفته دیگري مثل هیدروپونیک و آئروپونیک استفاده گردد.

  • نظرات
  • نظرات

      نظر شما کمک بزرگی برای بازدید کنندگان آینده است

      برای ثبت نظر شما کاربر گرامی لازم است ابتدا وارد حساب کاربری خود شوید.

    Copyright © 2020-2021. All rights reserved